Dr. Lionel Tintignac and Dr. Nitish Mittal, University of Basel

Abstract (Lay summary see below)

The imbalance between protein synthesis and protein degradation is a common pathogenic mechanism underlying muscle diseases. A higher rate of protein synthesis than the rate of protein degradation leads to hypertrophy, while a relatively lower rate of protein synthesis leads to atrophy. Understanding the regulators of these processes is a prerequisite for the development of therapeutic strategies to counteract atrophy. Although the vast majority of studies have focused on deciphering degradation processes that contribute to acute muscle breakdown (wasting), it is only recently that the proper functioning of the protein synthesis machinery in atrophying muscles has started to be questioned and investigated. We previously established that upon atrophy induction protein degradation directly targets protein synthesis. More recently, we identified an opposite link as well, demonstrating that increased protein synthesis initiation through sustained activation of mTORC1 in muscle (TSCmKO mouse model) does not leads to hypertrophy, but rather to activation of the unfolding protein response pathway. To follow up on these observations we have recently established a unique combination of cutting-edge techniques in our laboratories. We here proposed a 2-year project aiming to identify the molecular networks that specifically control protein synthesis and degradation in human myofibers under physiological conditions, and that are perturbed upon atrophic stress. Our strategy will be to integrate genome-wide measurements of 1) transcript levels (RNA-Seq), 2) translation levels (sequencing of Ribosome protected fragments, RPFs) and 3) protein levels (proteomics) from human myofibers. The ribosome footprinting technique will provide us, for the first time, with estimates of protein synthesis rates at individual RNA resolution, thus allowing us to further uncover the impact of these regulatory factors on translation of each gene. We will further apply a powerful technique that we have recently implemented, known as BioID, to map the direct interactome of the two main players we have already identified in atrophy. For this, we will engineer human myoblast cell lines to express endogenously chimeric BioID proteins. This will allow us to determine the direct interactomes of these proteins, as well as to investigate the translation process at extremely high resolution, because we will be able to isolate tagged ribosomes due to their interaction with our BioID chimeras and compare the pool of mRNAs interacting with these ribosomes with that of all ribosome-bound translated mRNAs. With this project we will define the mechanisms by which protein degradation and synthesis dysregulation promote muscle atrophy, which will open new avenues for drug discovery to counteract pathological muscle proteolysis and wasting.

Lay summary

La dérégulation de l’équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines (homéostasie protéique ou proteostasie) est un mécanisme pathogénique commun à la majorité des maladies affectant le muscle. Ainsi, une augmentation de la synthèse protéique au-delà du taux de dégradation est associée à un phénotype musculaire hypertrophique alors qu’une diminution de la synthèse protéique caractérise à l’inverse un phénotype atrophique. L’appréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents à ces processus est un prérequis aux développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre l’atrophie. Si à ce jour la grande majorité des études réalisées s’est focalisée sur l’identification des mécanismes de dégradation conduisant à une protéolyse musculaire accrue au cours de l’atrophie, ce n’est que très récemment que l’étude de la machinerie de synthèse protéique dans ces conditions a gagné en intérêt.

Nous avons précédemment mis en évidence que la machinerie de dégradation protéique cible spécifiquement la synthèse protéique durant l’atrophie. Plus récemment, nous avons établi un nouveau lien en démontrant que l’augmentation de l’initiation de la synthèse protéique, par l’hyper activation de la kinase mTORC1 dans le muscle (modèle murin TSCmKO), n’induit pas un phénotype musculaire hypertrophique mais résulte plutôt dans l’activation de la voie du stress liée à l’accumulation de protéines non repliées (Unfolded Protein Response ou UPR) ayant in fine des conséquences délétères pour le muscle. Afin d’approfondir ces observations nous avons mis au point une combinaison unique de techniques de pointes au laboratoire. Ainsi nous proposons à travers ce projet de 2 ans d’identifier les voies moléculaires qui contrôlent spécifiquement la synthèse et la dégradation des protéines dans les myofibres humaines en conditions physiologiques et en réponse au stress atrophique.

L’originalité de notre stratégie réside dans l’analyse génétique réalisée qui intégrera les mesures 1) à l’échelle transcriptionelle (RNA-Seq); 2) à l’échelle traductionnelle (séquençage des fragments protégés par les ribosomes, RPFs) ; 3) et enfin au niveau protéique (protéome). Le recours à la technique de profilage ribosomique (RPF) nous permettra ainsi pour la première fois de définir le taux de synthèse protéique relatif à chacun des ARNm (RNAseq), dans le but d’identifier les facteurs régulateurs de la traduction de chacun de ces gènes. D’autre part nous aurons recourt à la technique de BioID récemment développée au laboratoire permettant l’identification par étiquetage par la biotine des interactants proximaux et distaux de deux régulateurs principaux de l’atrophie déjà identifiés (impliqués dans la synthèse et la dégradation des protéines). Pour ce faire des myoblastes humains seront utilisés afin d’exprimer de manière endogène les protéines chimères BioID. Ainsi nous pourrons déterminer d’une part, les interactomes des protéines d’intérêt, et d’autre part définir avec précision les processus traductionnels impliqués car nous serons en mesure d’isoler les ribosomes biotinylés (ayant interagit avec les chimères BioID) et de comparer les pools d’ARNm régulés par ces ribosomes avec l’ensemble des ARNm en cours de traduction (RPF).

Dans son ensemble ce projet va permettre de définir les mécanismes par lesquels la dérégulation de la synthèse et de la dégradation des protéines initie l’atrophie musculaire ce qui devrait ouvrir de nouvelles pistes de travail dans le développement de molécules thérapeutiques pour lutter contre la protéolyse et la fonte musculaire.